オリゴDNA合成　よくあるご質問

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Q1. オリゴDNAの取扱い方法は？

Q2. オリゴDNAの保存方法は？

Q3. オリゴヌクレオチドの定量方法は？

Q4. 全く同じ配列あるいは同じ鎖長のオリゴDNAなのに、収量が異なる理由は？

Q5. 100塩基を超えるロングオリゴDNAは合成できますか？

Q6. 修飾オリゴDNAを注文したいのですが、対応可能な精製グレード、鎖長の制限を教えて下さい。

Q7. PCR産物に他のバンドが現れる理由は？

Q8. PCRが急に上手くいかなくなった理由は？

Q9. PCRのアニーリング温度

Q10. クローニングを目的としてオリゴDNAを使ったのですが、シーケンスを読んだところオリゴDNAの配列部分に変異がありました。製造中に変異が入ることはあるのですか？

Q11. マイオーダー画面のご説明　（注文履歴は確認できますか？）

取り扱いおよび保管方法

Q1.　オリゴDNAの取扱い方法は？

A1. ユーロフィンジェノミクスのカスタムDNAは、4つの精製グレード（Salt-free, OPC, HPLC）をご用意しております。
オリゴDNAは、精製グレードの違いにかかわらず、TE（pH8.0）または滅菌水による溶解を推奨しております。（滅菌水に比較して、TEでの溶解の方がより品質が安定であるため、特にTEを推奨致します。）
乾燥したオリゴDNAは透明なフィルム状あるいはペレット状となり、輸送途中で蓋や壁面に付着する場合があります。目視での確認が困難な場合もございますので、開封前には必ず10秒間程度スピンダウンをしてからご使用下さい。

Q2.　オリゴDNAの保存方法は？

A2. オリゴDNAは、凍結融解の繰り返しにより物理的な分解を受ける可能性があります。凍結融解によるダメージを防ぐために、分注してから保存して下さい。
また長期間（6ヶ月から1年程度）保存する場合は、乾燥状態で-20℃保存を推奨しております。一部の蛍光修飾オリゴDNAを除き、オリゴDNAは脱イオン交換水（弱酸性を示す）等で速やかに分解される可能性がありますので、弱アルカリ性バッファー（TEpH8.0 等）にて溶解をお願い致します。
但し、Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5蛍光修飾オリゴDNAの場合、弱アルカリ性バッファーで分解される可能性がありますので、pH7.0のバッファーにて溶解をお願い致します。
また蛍光修飾カスタムDNAは退色をさけるため、遮光した-20℃の冷暗所にて保存下さい。

オリゴヌクレオチドの定量・収量

Q3.　オリゴヌクレオチドの定量方法は？

A3. オリゴヌクレオチドはA260nmにおける吸光を測定することにより定量されます。
1O.D. （Optical Density）とは、A260nm=1になる濃度のオリゴヌクレオチド溶液1mlに含まれるオリゴヌクレオチドの質量と定義されます。すなわち、オリゴヌクレオチド全量を1mlに溶解した際のA260nmの値がOD値となります。

Q4.　全く同じ配列あるいは同じ鎖長のオリゴDNAなのに、収量が異なる理由は？

A4. 合成開始に使用する合成カラムに正確にCPG（Controlled Pore Glass;
3’側に位置する塩基あるいは修飾基が含まれる材料）が充填されていないことが考えられます。
合成スケール200nmolのカラムには、理論上200nmolのCPGであっても実際、それ以上含まれていることがあります。また精製を行うことにより収量が減少することから、最終的に名目上の合成カラムの収量と異なることになります。

注文時の鎖長の制限

Q5.　100塩基を超えるロングオリゴDNAは合成できますか？

A5.160塩基までの合成は可能です。
しかし、塩基配列の内容によっては、お請けできない場合もございます。また、精製グレードはHPLC、あるいはOPCの中から選択ください。詳しくは、お問い合わせください。

Q6.　修飾オリゴDNAを注文したいのですが、対応可能な精製グレード、鎖長の制限を教えて下さい。

A6. こちらをご覧下さい。

PCRの結果について

Q7.　PCR産物に他のバンドが現れる理由は？

A7. 互いのプライマー配列に相補的な領域があると、アニーリングし、目的とするものとは別の、比較的分子量の大きなPCR産物が得られる場合があります。
しかし、テンプレートが含まれていれば、テンプレートとプライマーが競合的に反応することで、この余計な産物は消失しますし、またアニーリング温度を上げることでも、この問題は解消されます。

Q8.　PCRが急に上手くいかなくなった理由は？

A8. 今までPCR反応が良好であったのに、増幅が起こらなくなるとしたら、プライマーやテンプレートの品質を確認する必要があります。
プライマーは納品後、チューブに分注し、凍結乾燥後-20℃に保存すれば、1年間程度使用可能です。しかし、プライマーの溶解に滅菌水を使用する場合、元となる純水装置のフィルター交換を行わないなどの理由により純水の品質が低下し、プライマーの分解につながることも考えられます。まず、この確認をお願いします。

Q9.　PCRのアニーリング温度

A9.Tm（融解温度）に対して、約5℃から10℃低い温度をまず計算します。
各プライマーでTmが異なる場合には、その平均値をとらず、Tmの低い方をアニーリング温度として使用して下さい。この後、アニーリング温度を上下させることにより、特異的な条件を求めます。

クローニング

Q10.　クローニングを目的としてオリゴDNAを使ったのですが、シーケンスを読んだところオリゴDNAの配列部分に変異がありました。製造中に変異が入ることはあるのですか？

A10.配列内の塩基の置換あるいは欠失は、製造中にまれに起こることがあります。
合成工程で脱プリン化（オリゴDNAの合成工程で強酸性試薬を使用するために起こる、アデニンの構造変化）されてしまうため、このオリゴDNA由来のクローンあるいはPCR産物が、シーケンス結果に影響を与えます。

また合成工程で、塩基が付加されなかったオリゴDNAの伸長を停止する「キャッピング」という反応がありますが、この化学反応が不完全ですと、配列途中に塩基が欠失したオリゴDNAを生じます。
脱プリン化、キャッピング不足とも、一部のオリゴDNAにのみ起こる場合が多いため、別のクローンを拾い、シーケンス結果をみることが必要となります。
オリゴDNAの配列が長くなればなるほど、これらの現象が起こる確率は高くなりますので、40塩基程度以上のオリゴDNAをご使用の場合には、シーケンス結果を見るために、5つ以上のクローンを目安に配列確認をお願い致します。

また、この他の原因として耐熱性DNAポリメラーゼの3'→5'エキソヌクレアーゼ活性により、PCR反応前に、このポリメラーゼがオリゴDNAの3'側を分解し、塩基配列の欠損が生じることも考えられます。
その他、オリゴDNA合成の原理上、精製を行わない場合、5'末端の塩基が欠失したオリゴDNAが除去されないままとなります。この不完全鎖長のオリゴDNAを元にPCR反応が起こると、制限酵素切断部位が形成されず、結果的に制限酵素により切断されなくなってしまいます。このため、このアプリケーションには、OPC精製以上を推奨します。