次世代シーケンス　よくあるご質問

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次世代シーケンス解析全般について

Q. ゲノムシーケンシングのデータ量はどの様に決めれば良いですか？: A. 変異解析を行う場合、ゲノムサイズの10〜30倍程度のシーケンスデータ量があると望ましいと思われます。場合によっては、10倍程度のread depthを以ってある程度変異の有り無しを見なす解析も考えられます。
Q. RNA-Seqのデータ量（リード数）はどの様に決めれば良いですか？: A. mRNA-Seqのリード数は、注目する遺伝子の発現量や細胞の状態により状況が大きく異なります。例えば、発現が少ないレアな遺伝子を見たい場合はリード数が多い方が望ましく、ある程度発現している遺伝子を見たい場合は、リード数を多くするより、replication数を増やした方が望ましいと思われます。また、類似の先行研究がありましたら、参考になるかもしれません。
どの程度のリード数を読めば良いか分からない場合はまずは小さな規模で解析を行って様子を見る、またはご予算に応じてお決めいただくことをお勧めします。
解析結果を検討して、シーケンシング量が不足するとお感じの場合には後日、ライブラリの追加シーケンシングも実施可能です。
Q. PacBioによるde novoシーケンシングとIllumina HiSeqによるシーケンシング、どちらを選ぶのが良いですか？: A. どちらを選ぶかは解析の目的によって異なってきます。PacBioとHiSeqを比べた場合、PacBioは長いサイズのアセンブルによりゲノムを十分にカバーすることが期待できる反面、シーケンスカバレッジを考えると、コストが高額になることが予想されます。一般に、PacBioを用いたde novoアセンブルを行う場合、ゲノムサイズの80倍程度のシーケンスデータ量が目安とされています。
ゲノムサイズが小さい場合や高品質のアセンブルを目指す場合はPacBioをお勧めしますが、ゲノムサイズが大きい場合やドラフトゲノムでも良い場合、またご予算などによっては、Illumina HiSeqも選択肢の一つになるかと思われます。
Q. バイオインフォマティクス解析はどのようなことができますか？: A. バイオインフォマティクス解析の詳細について詳しくはバイオインフォマティクス解析ページをご覧ください。
Q. お見積依頼、お問合せはどのように行えばよいですか？: A. ;お見積り・資料請求フォームからお問合せください。
Q. ユーロフィンジェノミクスの次世代シーケンスサービスを利用した論文はありますか？: A. 弊社次世代シーケンシングサービスを利用した論文につきましては、これまでご利用頂いた方のご協力も頂き、参考文献ページにリスト化しております。ご参考ください。

GRAS-Di^®解析について

Q. ジェノタイピングとは何ですか？: A. 検体ごとにDNA配列多型を決定することです。
Q. ジェノタイピングで求められることは何ですか？: A. どの程度のレベルで多型を決定するかということが重要になるかと存じます。
全ゲノム、既知SNP、一部領域、特定領域、など求める解析のレベルによって、解析方法も異なってきます。
Q. GRAS-Di^®解析でできることは何ですか？: A. ランダムプライマーを用いた2回のPCR反応によりゲノムワイドにアンプリコンを増幅後、配列決定を行い、アンプリコンの有無を基にしてジェノタイプの判定を行います。
Q. 1サンプルあたり、1 SNPあたりの価格はいくらですか？ サンプル数は○○を予定していますが、何サンプル解析できますか？ サンプル数は○○を予定していますが、何レーンの解析になりますか？ アンプリコン・マーカーはどれくらい取れて来て、どれくらいゲノムをカバーできますか？: A. 解析生物種のゲノムサイズや解析集団の種類（家系集団、自然集団、など）によって解析結果（マーカー数、SNP数）が変わってきますので、一概に申し上げるのは難しいです。

詳細な解析がされた実例としましては、イルミナ株式会社ウェビナーのイネ、サトウキビの例をご参考ください。
GRAS-Di^®技術でアンプリコンの増幅が確認された生物種については、対応生物種リストをご覧ください。

実例のないケースや生物種の場合には、まずは相乗りサービスで小規模な解析をお試し頂くことをお勧めいたします。
Q. トヨタ社のGRAS-Di^®ソフトウェアではどんな解析をしていますか？: A. 親サンプルが持つアンプリコンの情報を基にして、子サンプルでのアンプリコンの有無を判定します。
Q. トヨタ社のGRAS-Di^®ソフトの解析結果のExcelの見方を教えてください。: A. イルミナ株式会社ウェビナーの資料をご参考ください。
Q. GRAS-Di^®解析で共優性マーカーは判別できますか？: A. 2倍体、両親ホモ、分離集団の場合に限り、共優性マーカーを検出できます。
Q. DNAサンプルの条件は解析結果に影響しますか？: A. 弊社ではDNAサンプルのお受け入れ後に、濃度測定を行いますが、サンプルのDNA濃度が薄すぎますと、濃度測定のレンジから外れてしまい、正確に濃度を測れないことがございます。このような場合、PCRやシーケンスの結果にも影響する可能性があります。このため、濃度の規定値を設けさせて頂いております。

また、DNAの濃度測定はUV測定法をお願いしています。 GRAS-Di^®解析ではPCRによる増幅を行いますので、ssDNA（1本鎖DNA）+ dsDNA（2本鎖DNA）の総量を正確に測定することが安定したライブラリ増幅に必要な工程となります。そのため、dsDNA（2本鎖DNA）を特異的に濃度を測る蛍光測定法ではなく、 DNAの総量を測るUV法をお願いしています。
Q. DNAサンプルの送付に際して、指定の容器はありますか？: A. 輸送時の液漏れ防止あるいは解析作業を正確に行うため、サンプルは弊社で受入れ可能な容器をご利用ください。
　下記を満たしていれば、特に容器メーカーや型番の指定はございません。

● 96ウェルプレート [0.2ml]
　容器：容量0.2mlのセミスカート付96穴PCRプレート。透明。
　　　　※ノンスカートのものはご利用頂けません。
　フタ：8連キャップにて密閉。液漏れがないことを確認の上、ご送付ください。

他、対応不可のもの
（例）Thermofisher Scientific社：Matrix™ Blank and Alphanumeric Storage Tubes
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4253

● 8連チューブ [0.2ml]
　容器：容量0.2mlの8連PCRチューブ。透明。
　フタ：8連キャップにて密閉。
Q. GRAS-Di解析が上手くいかないことはありますか？: A. 極少数のケースで、アンプリコン増幅が上手くいかない事例があります。

・gDNAの分解が進み、アダプターダイマーの割合が増えてしまうケース
・夾雑物により、PCRがworkしないケース
（精製しても改善しないような、原因不明のケースもみられます。）
・バクテリアの混入によって、特定のアンプリコンが大きく増えるケース
・推奨のランダムプライマーが確認されていない生物種では、特定のアンプリコンが極端に多く増えるケースがみられます。このようなライブラリでも、シーケンス解析は可能ですが、特定アンプリコンにリードが偏ってしまいますので、非効率的と考えられます。
・PCR増幅ピークの程度によってはランダムプライマーの最適化が必須となるケース